O personagem principal da série é Monkey D. Luffy, um jovem pirata que deseja ter sucesso como Gol D. Roger, o falecido Rei dos Piratas, encontrando o seu tesouro, o One Piece. Durante a série, Luffy reúne sua própria tripulação pirata, denominada "Chapéu de Palha", incluindo o espadachim e caçador de recompensas Roronoa Zoro, a ladra e especialista em navegação Nami, o atirador covarde e mentiroso Usopp, o cozinheiro mulherengo e artista marcial Sanji, a rena antropomórfica e médico Tony Tony Chopper; a arqueóloga Nico Robin; o carpinteiro naval e ciborgue Franky; e o esqueleto vivo e músico Brook. Juntos, eles navegam pelos mares em busca de seus sonhos, encontrando outros piratas, caçadores de recompensa, organizações criminosas, revolucionários, agentes secretos e soldados do governo mundial corruptos, e vários outros amigos e inimigos.

A maioria dos personagens da série são seres humanos, mas o elenco também inclui, entre outros, gigantes, sereias, e tritões (seres híbridos de humanos e de peixes). Muitos dos personagens possuem habilidades sobrenaturais únicas adquiridas pela ingestão da chamada "Fruta do Diabo" ou Akuma no Mi.