Nascido no subúrbio de Chicago de Oak Park, Illinois, Castellaneta começou desde muito cedo a ter aulas de teatro. Ele ouvia os discos de comédia de seu pai e fazia imitações de artistas. Após graduar-se em Universidade de Northern Illinois, Castellaneta juntou-se a The Second City de Chicago, em 1983, ficando com o grupo até 1987. Ele foi do elenco de The Tracey Ullman Show, que estreou em 1987.

O The Tracey Ullman Show incluiu uma série de curtas animados sobre uma família disfuncional. Vozes foram necessários para os curtas, então os produtores decidiram pedir a Castellaneta para dublar Homer. Sua voz para o personagem começou como uma imitação de Walter Matthau, mas depois evoluiu para uma voz mais forte. Os curtas viriam a ser desmembrados em Os Simpsons. Castellaneta ganhou quatro Prêmios Emmy do Horário Nobre de Melhor Dublador em seu trabalho na série, bem como um Annie Award de Melhor Performance Individual no Campo da Animação em 1993. Castellaneta co-escreveu quatro episódios de Os Simpsons com a sua esposa Deb Lacusta.