Les hydrolases constituent une classe d'enzymes qui catalysent les réactions d'hydrolyse de molécules suivant la réaction générale : R-R' + H₂O ⇌ R-OH + R'-H On y trouve par exemple

• les estérases, qui hydrolysent les esters (R-CO-O~R'),
• les peptidases, qui hydrolysent les liaisons peptidiques (AA1-CO~NH-AA2),
• les glycosidases, qui hydrolysent les oligo- ou polysaccharides (sucre1-O~sucre2),
• les phosphatases, qui hydrolysent les produits phosphorés (exemple : ATP + H₂O ⇌ ADP + P).

Ces enzymes ne nécessitent pas en général de coenzymes. Elles sont activables par des cations.