Malpighi cresceu na fazenda de seus pais, e aos 17 anos ingressou na Universidade de Bolonha. Lá, começou a estudar filosofia aristoteliana. Quando seu pai, sua mãe e sua avó paterna morreram, Malpighi teve de abandonar seus estudos para cuidar da família. Retornou à universidade dois anos depois, e se formou doutor em medicina em 1653. Casou-se com Francesca Massari, irmã mais nova de seu professor de anatomia, em 1654. Ela morreu um ano depois.