Nato in Provenza, entrò nell'Ordine dei Cavalieri Ospitalieri e vi combatté i Turchi, dai quali venne fatto prigioniero e messo ai remi su una galea. Successivamente liberato, fece carriera fino a diventare Gran Maestro, la carica più alta dell'Ordine. Uomo di eccezionale energia, di lui si diceva che fosse capace "di governare un regno o di convertire un protestante". Da gran maestro, La Valette fu protagonista dell'assedio di Malta del 1565, quando l'isola venne assalita da una grande flotta turca: egli organizzò e diresse la resistenza, imponendo la tattica della difesa a oltranza di tutti i capisaldi, e partecipò di persona a diversi combattimenti, nonostante avesse ormai settantun'anni. In questo modo, nonostante la gravissima inferiorità numerica, i cavalieri di Malta resistettero per ben quattro mesi: infine, il 6 settembre, quando ormai entrambi i contendenti erano stremati, una flotta di soccorso spagnola sbarcò e mise i Turchi in fuga.