Avvocato in formazione venne nominato primo giudice della colonia di Santa Marta (sul litorale del nord della Colombia), dove arrivò nel 1535 con la flotta di Pedro Fernández de Lugo. Nel 1536 venne incaricato da de Lugo di comandare una spedizione per esplorare le terre interne della Colombia. Ad accompagnare Quesada nella spedizione vi era Hernán Pérez de Quesada (suo fratello), Juan il San Martín, Juan del Junco (secondo in comando) e Lázaro Fonte, parte verso il sud di Santa Marta, attraversato il fiume Cesar ed arrivò a Tamalameque sul fiume Magdalena. Inoltre una flotta di sostegno di 6 (o 5) navi era partita da Santa Marta con 800 uomini per risalire il fiume Magdalena. Soltanto due dei vascelli arrivarono realmente a Tamalameque e successivamente ripartirono per Santa Marta con molti degli uomini di Quesada.