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CRISPR
O sistema CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um “protoespaçador” (“espaçador de DNA”), que corresponde a uma região não-codificante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locus CRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores . No entanto, este sistema não é restrito a bactérias, o gigantesco Mimivírus se defende de invasores utilizando um semelhante sistema CRISPR implementado por bactérias e outros microorganismos. O sistema de defesa do Mimivírus pode levar a novas ferramentas de edição de genoma.
Diversos são os mecanismos pelos quais a molécula de RNA guia pode ser sintetizada, entretanto, o sistema tipo II no qual baseiam-se os sistemas atualmente disponíveis para realização da edição gênica, requer a presença de um RNA transativador (tracRNA), e uma molécula pequena de RNA complementar à sequência repetida capaz de associar-se ao transcrito inicial do locus CRISPR, denominada CRISPR RNA (crRNA-sequências que consistem em um protoespaçador ligado a uma sequência repetida com estrutura de grampo). Esta associação origina o complexo tracRNA-crRNA, uma molécula de RNA dupla fita que após ser processada pela RNase III é convertida em uma molécula híbrida madura com função importante no que diz respeito à associação e direcionamento de uma nuclease para eliminação do DNA invasor. Nesse sistema especificamente, a nuclease envolvida na clivagem refere-se à Proteína Associada a CRISPR 9 (Cas9) .
A alta taxa de insucesso, custo elevado e excesso de tempo necessário para realização das metodologias disponíveis para edição gênica, tais como Recombinação Homóloga (comumente empregada na manipulação genica de células tronco), Nucleases Dedos de Zinco (ZFN, do inglês Zinc Fingers Nucleases) e Nucleases Efetoras semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês Transcription Activator–like Effector Nucleases), estas duas últimas requerem o reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a clivagem promovida por nucleases sintetizadas especificamente para tais metodologias seja bem sucedida, o que nos permite considerar tais métodos mais trabalhosos quando comparados ao sistema CRISPR .
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